Мікробіом ротової порожнини NGS

Ротова порожнина — друга за мікробним різноманіттям ніша людського організму після кишечника: понад 700 видів бактерій, організованих у шість анатомічно ізольованих мікросередовищ — ясенна борозна, піддесневі кишені, спинка язика, слизова щік, тверде піднебіння та слина. Кожне має власний мікробний профіль і власні клінічні наслідки при його порушенні.

Порушення балансу цієї спільноти — оральний дисбіоз — це не просто «наліт», а керований чинник, що лежить в основі пародонтиту, періімплантиту, рефрактерного галітозу та кореневого карієсу, а також асоційований із системними станами. Для клініциста ключове те, що дисбіоз піддається кількісній оцінці, а отже, лікування можна персоналізувати, а не призначати «наосліп».

Секвенування нового покоління (Next-Generation Sequencing, NGS) орального мікробіому — це молекулярно-генетичний метод, який зчитує ДНК усіх мікроорганізмів у зразку одночасно і будує кількісний профіль усього мікробного пейзажу, а не здійснює пошук окремого патогена.

В арсеналі стоматологічної мікробіологічної діагностики традиційно використовують два інструменти, і обидва мають принципові обмеження.

Бактеріологічний посів виявляє лише ті мікроорганізми, які здатні рости в лабораторних умовах. Основна маса пародонтальних патогенів — облігатні анаероби. Вони гинуть при контакті з киснем ще на етапі транспортування, тому у стандартному посіві можуть не виявлятися. У результаті метод дає неповну і нерідко хибно-заспокійливу картину.

Мультиплексна полімеразна ланцюгова реакція — цільова ПЛР-панель — точний і швидкий метод, однак він обмежений переліком мікроорганізмів, включених до панелі, зазвичай це 5–15 видів. Усе, що не входить до панелі, залишається невидимим. Наприклад, Solobacterium moorei — один із ключових продуцентів сірковмісних сполук при галітозі — часто не включений до стандартних панелей.

Секвенування нового покоління усуває обидва ці обмеження. Метод ампліфікує варіабельні ділянки гена 16S рибосомальної РНК і порівнює отримані послідовності з референсними базами орального мікробіому, зокрема eHOMD і SILVA.

Результат дослідження — кількісний профіль понад 500 видів мікроорганізмів одночасно із зазначенням відносної рясності кожного з них, включно з облігатними анаеробами, рідкісними та потенційно новими патогенами.

Як працює метод

1. Забір матеріалу з клінічно значущої ділянки — піддесневої кишені, зони імпланта, поверхні язика тощо — у стабілізуючий буфер.
2. Виділення ДНК з усіх клітин зразка. Метод не потребує наявності живих мікроорганізмів.
3. Ампліфікація гена 16S рРНК, зокрема регіонів V3–V4, — універсального бактеріального «штрих-коду».
4. Секвенування на платформі Illumina MiSeq.
5. Біоінформатичний аналіз — зіставлення отриманих послідовностей із референсними базами eHOMD і SILVA, підрахунок та нормалізація результатів.
6. Клінічна інтерпретація — переведення таблиці таксонів у клінічно значущий висновок.

Як читається результат: інтерпретаційні рамки

Перелік сотень видів без клінічного контексту — лише великий список. Клінічну цінність результату надає інтерпретаційна рамка.

Комплекси Socransky (1998) — базовий рівень інтерпретації. Бактерії існують не як випадковий набір, а як стійкі мікробні комплекси з різним патогенним потенціалом:

• Червоний комплекс — Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola. Головний маркер активного пародонтиту.
• Оранжевий комплекс — Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Parvimonas micra. Виконує роль «містка», що створює умови для колонізації представниками червоного комплексу.
• Жовтий комплекс — Streptococcus mitis, Streptococcus gordonii. Представники захисної флори, зниження яких може бути раннім сигналом дисбіозу.
• Зелений і фіолетовий комплекси — переважно нейтральна флора ранніх колонізаторів.

GF-MoR (2024) — сучасна рамка нозологічної стратифікації, що включає 67 мікробних кластерів, пов’язаних із конкретними діагнозами, зокрема пародонтитом, періімплантитом і системними асоціаціями.

Практичне правило: класифікація Socransky відповідає на запитання «що виявлено і наскільки це патогенно», а GF-MoR — «до якого клінічного стану цей мікробний профіль найближчий».

Показання: кому призначено дослідження

Дослідження призначає стоматолог або пародонтолог у клінічно окреслених ситуаціях. Рівень доказовості B — проспективні когортні дослідження та клінічні настанови.

1. Рефрактерний пародонтит III–IV ступеня тяжкості — для персоналізованого вибору системної антибіотикотерапії відповідно до протоколу EFP S3. Домінування Aggregatibacter actinomycetemcomitans понад 1% може бути підставою для розгляду комбінації амоксициліну з метронідазолом, а переважання представників червоного комплексу — метронідазолу або комбінованої терапії.
2. Контроль ефективності пародонтологічного лікування при неоднозначному клінічному результаті через 3–6 місяців, зокрема перед ухваленням рішення про хірургічне втручання.
3. Імплантологія — передопераційна оцінка залишкового патогенного резервуару та моніторинг періімплантиту. Мікробний профіль при періімплантиті може відрізнятися від профілю, характерного для пародонтиту.
4. Хронічний галітоз, резистентний до базової терапії — для виявлення продуцентів летких сірковмісних сполук, зокрема Solobacterium moorei та Atopobium parvulum, які можуть не входити до стандартних цільових панелей.
5. Множинний кореневий карієс у пацієнтів старшого віку — для диференціації мікробної сигнатури та вибору антимікробної тактики.
6. Цукровий діабет 2 типу з рефрактерним пародонтитом, зокрема при HbA1c понад 7,5%, — для розмежування мікробіологічних і метаболічних чинників неефективності лікування.
7. Агресивний перебіг пародонтиту у пацієнтів віком до 35 років — для виявлення атипових або рідкісних збудників.

Дослідницький напрям, рівень доказовості C: асоціації оральних патогенів із системними захворюваннями, зокрема хворобою Альцгеймера, колоректальним раком та атеросклерозом, задокументовані, однак клінічних протоколів із доведеною терапевтичною значущістю наразі немає.

Дослідження не показане: за відсутності скарг і клінічних знахідок у здорових осіб. Скринінг без чітко сформульованого клінічного питання є малоінформативним.

Що отримують пацієнт і лікар

• Кількісний профіль — відносна рясність усіх виявлених таксонів із максимально можливою ідентифікацією до рівня виду.
• Клінічну інтерпретацію за комплексами Socransky та маркерами GF-MoR.
• Практичні рекомендації для лікаря — без надмірного переліку сотень видів, із фокусом на клінічно значущій інформації, необхідній для вибору подальшої тактики.

Підготовка до дослідження

1. Не приймати системні та місцеві антибіотики щонайменше протягом 4 тижнів до забору матеріалу.
2. Не приймати пробіотики щонайменше протягом 2 тижнів до забору.
3. Не застосовувати антисептичні ополіскувачі для ротової порожнини, зокрема засоби з хлоргексидином, цетилпіридинієм або ефірними оліями, щонайменше протягом 3 днів до забору.
4. Не проводити професійну гігієну ротової порожнини, зокрема скейлінг, полірування та місцеві антисептичні процедури, щонайменше протягом 2 тижнів до забору.
5. Напередодні ввечері провести звичайне чищення зубів без використання антисептичного ополіскувача.
6. Уранці в день забору не чистити зуби, не їсти й не пити нічого, крім чистої води, щонайменше протягом 2 годин до процедури.
7. Не жувати жувальну гумку та не використовувати зубну нитку в день забору до моменту взяття зразка.
8. Забір матеріалу необхідно виконати до початку будь-якого стоматологічного лікування або маніпуляцій.

Важливо: преаналітичний етап є однією з найчастіших причин неінформативного результату. Неправильний вибір ділянки забору або порушення правил підготовки може суттєво знизити точність і клінічну цінність дослідження.